Полимеразная цепная реакция или ПЦР — экспериментальный метод молекулярной биологии и генетики, который повсеместно используется как в клинических лабораториях для диагностики заболеваний, так и в научных целях для исследования молекулярных механизмов клетки. Американский биохимик Кэри Муллису, создавший ПЦР в 1983 году и опубликовавший этот метод два года спустя, в 1993 году получил за неё Нобелевскую премию по химии. Разумеется, широко применяется ПЦР и в области нейронаук и нейротехнологий.
Принцип ПЦР состоит в многократном копировании определенного участка ДНК, которое может проводиться в пробирке (in vitro), в клетках и тканях (in situ) и даже виртуально в компьютере (in silico). Для получения необходимого количества ДНК достаточно взять небольшой сегмент матричной ДНК и добавить:
— праймеры – короткие фрагменты ДНК, которые играют роль затравки для начала синтеза ДНК,
— Тaq-полимеразу — фермент, выделенный когда-то из привычных к теплу бактерий Thermus aquaticus. Он ускоряет реакцию и не боится нагревания,
— дезоксирибонуклеотидтрифосфаты — dATP, dGTP, dCTP, dTTP,
— буферный раствор и ионы Mg2+, чтобы все работало.
Реакция ПЦР в зависимости от желаемого количества продукта ДНК на выходе, может выполняться многократно, проходя одни и те же стадии:
1) Денатурация
Смесь прогревают до 95 градусов, чтобы, во-первых, спирали ДНК раскрутились и разъединились и стали «плавать» в растворе отдельно друг от друга, а во-вторых, чтобы при нагревании разрушились все чужеродные белки, которые могут помешать будущей реакции.
2) Отжиг
Затем смесь охлаждают до 37-65 градусов, так как именно при этой температуре происходит так называемый отжиг праймеров, то есть они связываются с нужными местами на матричных цепях, откуда будут затем запускать синтез цепочки-двойника, потерянного при нагревании.
3) Элонгация
Собственно наращивание матричной ДНК с участием Тaq-полимеразы, после чего цикл повторяется. Количества ДНК в смеси после завершения каждого цикла удваивается и, следовательно, по мере прохождения реакции увеличивается по экспоненте.
бромистый этидий
В финале содержимое смеси анализируют с помощью электрофореза в агарозном геле с бромистым этидием. Это вещество флюоресцирует оранжевым светом, а когда этидий связывается с ДНК, интенсивность флюоресценции увеличивается в 20 раз. Электрофорез разделяет участки ДНК по длине, а результат можно сравнить с эталонным набором; Готовую ДНК можно выделить из агарозного геля и подвергать любым дальнейшим исследованиям, так как она практически ничем не будет отличаться от первоначального варианта.
результат электрофореза ДНК в агарозном геле. Оранжевые штрихи - флюоресценция ДНК
При сравнению с другими методами ПЦР выигрывает своей простотой и относительной дешевизной, обладая тем не менее высокой специфичностью реакции, точностью и эффективностью синтеза ДНК. Из многих разновидностей ПЦР особый интерес представляет ПЦР в реальном времени (PCR-real time), при которой с помощью флюоресцентно-меченных праймеров можно посчитать количественное увеличение ДНК в каждом цикле реакции.